PEI转染试剂的配制步骤是什么?

　　PEI(聚乙烯亚胺)转染试剂是一种高效、低成本的非脂质体聚合物转染试剂，广泛应用于哺乳动物细胞、昆虫细胞及部分植物细胞的DNA、siRNA等核酸的转染。其配制步骤需严格遵循无菌操作，并注意浓度、pH值及储存条件，以下是详细的配制步骤及注意事项：
 

　　一、配制前准备
 

　　材料与试剂
 

　　PEI粉末(分子量通常为25 kDa或40 kDa，需根据实验需求选择)
 

　　超纯水(或无内毒素水)
 

　　1 M HCl(用于调节pH)
 

　　1 M NaOH(备用)
 

　　0.22 μm滤膜(无菌过滤用)
 

　　无菌离心管、移液器、磁力搅拌器(可选)
 

　　个人防护
 

　　佩戴实验服、手套和护目镜，避免直接接触PEI粉末(可能刺激皮肤和呼吸道)。
 

　　二、配制步骤
 

　　1. 溶解PEI粉末
 

　　计算质量：根据目标浓度(常用1 mg/mL)和所需体积，计算PEI粉末质量。
 

　　示例：配制10 mL 1 mg/mL PEI溶液，需称取10 mg PEI粉末。
 

　　溶解：将PEI粉末加入适量超纯水(如5 mL)，涡旋或磁力搅拌至完全溶解(可加热至50-60℃加速溶解，但需避免高温破坏结构)。
 

　　定容：将溶解后的溶液转移至容量瓶或离心管，用超纯水定容至目标体积(如10 mL)。
 

　　2. 调节pH值
 

　　初始pH：PEI溶液初始pH通常较低(约1-2)，需用1 M HCl或NaOH调节至生理兼容范围(pH 7.0-7.4)。
 

　　操作：
 

　　逐滴加入1 M NaOH，边加边搅拌，同时用pH试纸或pH计监测，直至pH达7.0-7.4。
 

　　若pH过高，可用1 M HCl回调。
 

　　3. 无菌过滤
 

　　过滤：将调节好pH的PEI溶液通过0.22 μm滤膜无菌过滤，去除杂质和微生物。
 

　　注意：
 

　　过滤前需确保滤膜和过滤装置无菌。
 

　　若溶液体积较大，可分次过滤或使用真空过滤装置。
 

　　4. 分装与储存
 

　　分装：将过滤后的PEI溶液按实验需求分装至无菌离心管(如1 mL/管)，避免反复冻融。
 

　　储存：
 

　　短期使用(1-2周)：4℃保存。
 

　　长期保存：-20℃或-80℃冷冻，可稳定数月至一年。
 

　　避免反复冻融：每次取用后立即放回冷冻环境。
 

　　三、关键注意事项
 

　　浓度优化
 

　　PEI浓度需根据细胞类型和转染效率优化。常用范围为1-10 μg/mL(按DNA质量计算)，但需通过预实验确定最佳比例(如PEI:DNA质量比为1:1至6:1)。
 

　　pH敏感性
 

　　PEI的转染效率受pH影响显著。pH过低(<6.5)可能导致细胞毒性，pH过高(>7.5)可能降低转染效率。
 

　　无菌操作
 

　　PEI溶液易受微生物污染，配制全过程需严格无菌，避免影响细胞活性。
 

　　内毒素控制
 

　　若用于敏感细胞(如原代细胞或干细胞)，建议使用无内毒素水配制，并检测内毒素水平(<0.1 EU/mL)。
 

　　避免金属离子污染
 

　　PEI可能与金属离子(如Ca²⁺、Mg²⁺)结合，影响转染效率。配制时避免使用含金属离子的试剂或容器。
 

　　四、预实验建议
 

　　细胞兼容性测试：首次使用前，在目标细胞中测试PEI的细胞毒性(如MTT实验)和转染效率(如荧光报告基因)。
 

　　浓度梯度优化：设置PEI浓度梯度(如1、2、4、6 μg/mL)，确定最佳转染条件。
 

　　对照实验：设置空白对照(无PEI)和阳性对照(已知高效转染试剂)，验证实验可靠性。
 

　　五、PEI(聚乙烯亚胺)转染试剂常见问题解决

 

　　转染效率低：检查PEI浓度、pH值、细胞状态及DNA质量。
 

　　细胞毒性高：降低PEI浓度或缩短转染时间，优化转染后培养条件(如更换新鲜培养基)。
 

　　溶液浑浊或沉淀：可能因pH不当或金属离子污染导致，需重新配制并过滤。